1、小鼠ES細胞　　小鼠ES細胞的分離方法基本成熟，且已廣泛應用于生命科學研究的各個領域。

(相關資料圖)

2、1981年Evans首次分離得到小鼠ES細胞，他以手術切除受精后2.5d小鼠卵巢并結(jié)合激素注射干擾子宮環(huán)境，從而使胚胎延遲著床，再回收胚胎，將其體外培養(yǎng)于STO細胞飼養(yǎng)層上，結(jié)果得到了小鼠ES細胞系。

3、MartinGR以免疫外科法剝離小鼠囊胚滋養(yǎng)層細胞，得到內(nèi)細胞團(ICM)并將其置于STO細胞飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)基為小鼠PSA-1ES細胞條件培養(yǎng)基，結(jié)果也得到小鼠ES細胞。

4、此后，Axelord等用微滴法得到小鼠ES細胞系；Kaufman等用單倍體延遲著床小鼠囊胚建立同源二倍體ES細胞系；Wobus等首次用原代小鼠成纖維細胞作飼養(yǎng)層建立了小鼠ES細胞系；Smith等首次使用大鼠肝細胞條件培養(yǎng)基作為分化抑制物建立了小鼠ES細胞系。

5、BrookFA等進一步完善了小鼠ES細胞的分離方法，以致從許多品系小鼠包括近交系和突變系，都可獲得ES細胞。

6、體細胞核移植分離小鼠ES細胞并非只能從囊胚，也并非必須依賴飼養(yǎng)層細胞。

7、Dhhaise等將52枚8-細胞小鼠胚胎消化成單個分裂球并培養(yǎng)于小鼠原代成纖維細胞飼養(yǎng)層上，所用培養(yǎng)基為DMEM/F12，并添加100mL/L的胎牛血清、100mL/L的新生犢牛血清和0.1mmol/L的2-巰基乙醇，5天后，出現(xiàn)多個干細胞集落，消化傳代后建立了一個ES細胞系MSB1。

8、將MSB1注入SCID(severecombinedimmunodeficientmice)小鼠，能產(chǎn)生包含三胚層分化物的畸胎瘤，注入52枚囊胚產(chǎn)生了2個活的個體(1雄，1雌)，但雄性個體無生殖能力。

9、Tojo等用同樣方法從雜交小鼠(C57BL/6×DBA/2)8-細胞胚也得到了ES細胞。

10、小鼠ES細胞具有無限增殖的自我更新能力。

11、SudaY等將小鼠ES細胞傳250代以上沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)化的跡象，它們?nèi)跃哂姓５亩扼w核型；在生殖系嵌合體中能產(chǎn)生正常的配子；作為核供體能重組克隆胚胎。

12、上述結(jié)果表明小鼠ES細胞是永生性的。

13、大鼠ES細胞　　IannacconePM等從大鼠PVG近交系分離克隆大鼠ES細胞系-RESC-01，該細胞系對SSEA-1和AKP呈陽性，在大鼠胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層上能很好的增殖，在體內(nèi)環(huán)境能分化形成多種細胞類型。

14、RESC-01細胞系在體外懸浮培養(yǎng)時形成的胚體出現(xiàn)有節(jié)律的收縮運動，將其注入囊胚并移植假孕母鼠能生成嵌合體。

15、Kawase等也利用大鼠胎兒成纖維細胞做飼養(yǎng)層，從DA大鼠品系分離建立了RES-DA1ES細胞系，它與小鼠ES細胞形態(tài)相似，表達AKP和4C9抗原。

16、Brenin等也用不同的方法分離得到了ES細胞。

17、Sun等以大鼠ES細胞為核供體，得到了核移植后代。

18、Vassilieva等發(fā)現(xiàn)大鼠ES細胞表達SSEA-Oct-4和IL-6等細胞標記。

19、豬ES細胞　　PiedrahitaJA等采用STO、豬成纖維細胞和豬子宮上皮細胞作為飼養(yǎng)層，以DMEM為基礎培養(yǎng)液，從豬囊胚ICM分離ES細胞，發(fā)現(xiàn)豬囊胚ICM在STO或PMEF飼養(yǎng)層上可以附著增殖，而在豬胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層上雖可附著但增殖甚微，傳不過4代即發(fā)生死亡。

20、Evans等將6天～7天豬囊胚直接培養(yǎng)于STO飼養(yǎng)層上，挑出ICM細胞經(jīng)增殖傳代培養(yǎng)建立了豬ES細胞系。

21、StrojekRM等認為分離豬ES細胞的最適胚胎為第10天囊胚。

22、研究表明，6日齡～7日齡胚胎在培養(yǎng)過程中極易發(fā)生死亡，IC胚胎干細胞研究(16張)M克隆獲得率極低，而第10天的胚胎容易培養(yǎng)，ICM克隆獲得率較高，但細胞易于分化。

23、Vasil’evIM等研究了胚胎發(fā)育階段、培養(yǎng)基種類、飼養(yǎng)層細胞等影響豬ES細胞分離的因素，結(jié)果表明不同發(fā)育階段的附植前囊胚是影響豬ES細胞分離的限制性因素。

24、WheelerMB等報道豬ES細胞能形成正常的嵌合體和包含三胚層分化物的囊狀胚體，在維甲酸和DMSO的作用下，豬ES細胞能分化形成上皮細胞、肌肉細胞、脂肪細胞、成纖維細胞等，Miyoshi等從體外授精囊胚分離得到豬ES細胞，并以類ES細胞為核供體，獲得了核移植囊胚。

25、國內(nèi)關于豬ES細胞分離克隆的研究相對較少，李松等分離得到豬ES細胞并傳至第2代，在此基礎上，徐軍等將豬ES細胞傳至3代，馮秀亮等將豬ES細胞傳至5代，馮書堂等也分離得到豬ES細胞，同時對所分離的細胞進行了初步檢測和鑒定，證明其具有多能性。

26、牛ES細胞　　Saito等在加有LIF的培養(yǎng)基中對牛ICM進行培養(yǎng)，分離得到牛ES細胞并進行傳代。

27、Sims等使用與一般ES細胞分離完全不同的低密度培養(yǎng)法，使用BRL(buffaloratliver)條件培養(yǎng)基并添加亞硒酸鈉、胰島素、運鐵蛋白和50mL/L胎牛血清，培養(yǎng)6d～10d，得到15個ES細胞系，將其作為核供體進行核移植得到659枚重構(gòu)胚，卵裂率70%，囊胚率24%，將其中34枚胚胎移植27頭假孕母體，13頭妊娠，最后生出4頭犢牛。

28、而SticeSL等報道，以牛ES細胞為核供體建立的重組胚在移植受體后雖然會出現(xiàn)妊娠現(xiàn)象，但妊娠時間不超過60天，主要是因為胎盤畸形發(fā)育，包括缺乏子葉以及子宮阜出血反應。

29、若將重組胚與正常8-細胞胚嵌合，則該嵌合胚可發(fā)育至85天，胎兒同樣缺乏子葉，DNA分析證實50%的嵌合體胎兒組織來源于ES細胞。

30、Ito等分析比較了牛體內(nèi)和體外培養(yǎng)的桑椹胚分裂球和囊胚ICM分離ES細胞的效果，結(jié)果僅在囊胚組獲得了類ES細胞。

31、Cibelli等由49枚7日齡牛胚胎ICM分離到27個ES細胞系，用注射法將β-半乳糖苷酶基因?qū)隕S細胞，選擇轉(zhuǎn)染的ES細胞注入8-細胞～16-細胞牛胚，其中18枚胚胎移植7頭受體，妊娠5周后，得到12個胎兒。

32、對胎兒進行檢測，6個胎兒分別在生殖腺或原始生殖細胞(PGCs)中檢測到標記基因，表明ES細胞參與生殖系嵌合。

33、Cibelli等建立應用牛胎兒成纖維細胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛類ES細胞的方法，得到6頭嵌合體。

34、Mitalipova等自致密桑椹胚分離牛ES細胞，最高一株ES細胞傳至150代，且表達SSEA-SSEA-3、SSEA-4和c-kit受體。

35、羊ES細胞　　Handyside等以綿羊皮膚成纖維細胞和胎兒成纖維細胞作飼養(yǎng)層，從7日齡～8日齡綿羊囊胚分離類ES細胞，結(jié)果得到內(nèi)胚層樣細胞而無ES細胞出現(xiàn)。

36、Tsuchiya用免疫外科法分離8d～9d綿羊囊胚ICM，培養(yǎng)于STO細胞飼養(yǎng)層上，得到2個類ES細胞系，傳至4代。

37、Tillmann等用胎牛肝成纖維細胞作飼養(yǎng)層分離得到傳至20代的綿羊類ES細胞和40代的山羊類ES細胞。

38、Modinski等將綿羊ES細胞與囊胚嵌合得到2只嵌合體綿羊。

39、Campbell等用第1代～第3代的類ES細胞作核供體進行核移植，得到了4只綿羊。

40、兔ES細胞　　GravesKH等從兔子附植前囊胚分離得到ES細胞，并進行了初步鑒定，證明它們具有在飼養(yǎng)層上保持未分化狀態(tài)的增殖能力，體外傳代培養(yǎng)1年以上，仍具有正常的核型，且能形成包含三胚層分化物的胚體。

41、之后，Niemann等以PMEF為飼養(yǎng)層，建立了9個兔ES細胞系。

42、SchoonjansL等將兔ES細胞注入囊胚獲得了包括生殖系在內(nèi)的嵌合體兔子。

43、陳穎等以PMEF為飼養(yǎng)層培養(yǎng)兔分割囊胚，結(jié)果得到傳至7代的兔ES細胞，將第2代的兔ES細胞與囊胚進行嵌合，得到1只皮毛嵌合體仔兔，但未證實ES細胞是否參與了生殖系嵌合。

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